Université Joseph Fourier  Grenoble I
THÈSE
pour obtenir le grade de
Docteur de l'Université Joseph Fourier  Grenoble I
Spécialité : Physique
présentée et soutenue publiquement par
Pascale VÉRANT
le 10 juillet 2006
Imagerie intravitale par microscopie biphotonique :
application à l'étude des effets
de la radiothérapie synchrotron par microfaisceaux
sur la microvascularisation corticale de la souris
Composition du jury
M Laurent BOURDIEU , Rapporteur
M. Serge CHARPAK , Rapporteur
M. François ESTÈVE , Président
M. Boudewijn VAN DER SANDEN , Co-directeur de Thèse
M. Jean-Claude VIAL , Directeur de Thèse
M. Georges WAGNIÈRES , Examinateur
Laboratoire de Spectrométrie Physique  CNRS UMR 5588

Introduction 
1 Imagerie intravitale et microscopie biphotonique 
1.1 Intérêts et difficultés de l'imagerie intravitale 
- L'imagerie optique intravitale 
- Présentation de différentes stratégies pour réaliser de l'imagerie
optique en milieu turbide 
- La microscopie optique 
1.2 Microscopie biphotonique 
1.2.1 Principes de base 
- Le processus d'excitation par absorption à deux photons 
- Section efficace de fuorescence à deux photons 
1.2.2 Caractéristiques 
- Excitation localisée et résolution spatiale 
- Profondeur d'exploration 
1.2.3 Colorants : nature et marquage 
1.2.4 Une limite : les photodommages 
1.2.5 Applications 
1.3 Rapide tour d'horizon d'autres techniques de microscopie non linéaire . . . 31
2 Un petit tour du côté du cerveau 
2.1 Une brève description du cerveau 
2.1.1 Anatomie fonctionnelle du système nerveux central 
- Protections du SNC 
2.1.2 Le cerveau : description des différents types cellulaires 
2.1.3 La vascularisation cérébrale 
- Vascularisation et microvascularisation cérébrale 
- La barrière hémato-encéphalique (BHE) 
2.2 Méthodes intravitales d'exploration du cerveau 
2.2.1 Présentation des différentes méthodes 
2.2.2 Études réalisées sur le cerveau par microscopie biphotonique 
2.3 Tumeurs cérébrales et radiothérapie 
2.3.1 Quelques mots sur les tumeurs cérébrales 
2.3.2 Les traitements des tumeurs 
- La chirurgie 
- La chimiothérapie 
- La radiothérapie 
2.3.3 La radiothérapie par microfaisceaux 
3 Matériels et méthodes
3.1 Déroulement d'une expérience : de l'irradiation à l'observation par microscopie biphotonique 
3.2 L'irradiation synchrotron par microfaisceaux 
- La source des rayons X 
- L'irradiation par microfaisceaux 
3.3 La microscopie biphotonique dans notre expérience 
3.3.1 L'imagerie par microscopie biphotonique 
- Préparation des animaux 
- Imagerie par microscopie biphotonique 
- Acquisitions .
3.3.2 Choix des colorants 
3.3.3 Description et caractérisation de différents éléments du montage 
- Le laser d'excitation 
- Amélioration du dispositif de variation de puissance incidente 
- Le balayage du faisceau 
- L'objectif 
- La détection 
- Amélioration du système d'acquisition et de l'interfaçage .
3.4 Les autres techniques utilisées 
3.4.1 Les différents marquages histologiques 
3.4.2 Etudes complémentaires par IRM de diusion et micro-gravimétrie 
- Micro-gravimétrie 
- IRM de diffusion 
4 Étude des effets de la radiothérapie synchrotron par microfaisceaux sur la microvascularisation 
4.1 Présentation de l'étude 
4.2 Campagnes de mars et juin 2004 
4.2.1 Observations par microscopie biphotonique 
- Le protocole 
- Les observations 
4.2.2 Analyses histologiques 
4.2.3 Bilan de la campagne et discussion 
4.3 Campagnes d'août 2004, février et septembre 2005 
4.3.1 Observations par microscopie biphotonique 
- Le protocole 
- Les observations 
4.3.2 Etudes par gravimétrie et IRM de diffusion 
4.3.3 Analyses histologiques 
4.3.4 Bilan de la campagne et discussion 
4.4 Campagne de mars 2006 
4.4.1 Mais que sont ces points rouges ? 
- État des lieux des hypothèses sur l'origine de ces points rouges
- Protocole des observations récentes pour la détermination de la nature des points rouges 
- Les observations par microscopie biphotonique 
- Discussion 
4.4.2 Variation de la taille des microfaisceaux 
4.5 Bilan et discussion de l'ensemble des campagnes 
5 Méthode de mesure du volume sanguin cérébral 
5.1 Cadre de l'étude 
5.2 Présentation de la méthode de mesure du volume sanguin cérébral (VSC) 
5.2.1 Démonstration théorique du principe de la méthode 
- Cas d'une excitation laser ponctuelle 
- Prise en compte de l'extension spatiale de l'excitation 
- Normalisation des images 
- Prise en compte de l'atténuation de la lumière avec la profondeur
5.2.2 Mise en oeuvre de cette méthode sur nos acquisitions 
- Justication de l'utilisation de notre méthode 
- Traitement des acquisitions pour la détermination du VSC 
5.3 Validation de notre méthode 
5.3.1 Par simulation 
- Description du fantôme numérique 
- Effets de chaque étape du traitement d'images pour la mesure du VSC explorés sur le fantôme
5.3.2 Essais de validation expérimentale 
- Variation du VSC par hypercapnie ? 
- Variation du VSC consécutive au décès ? 
- Reproductibilité des mesures 
5.4 Applications, limitations et perspectives de cette méthode
5.4.1 Mesure du volume sanguin cérébral sur souris saines 
- Le volume capillaire plasmatique cérébral. Prise en compte de l'hématocrite 
- Variabilité en fonction de la zone explorée 
- Réabsorption de la fluorescence émise 
- Comparaison avec les valeurs de la littérature 
- Conclusions et perspectives 
5.4.2 Etude des effets de la MRT sur le volume sanguin cérébral 
6 Compléments sur l'étude de la perméabilité de la BHE par microscopie biphotonique 
6.1 Échanges à travers la BHE 
6.1.1 Les différents mécanismes d'échanges à travers une membrane cellulaire. Spécificités de la BHE
6.1.2 Comment alors faire passer des agents thérapeutiques à travers la BHE? 
6.1.3 Diffusion libre de petites molécules à travers la BHE : quelques critères
- Qu'en est-il des colorants que nous utilisons ? 
6.2 Mesure de la perméabilité vasculaire 
6.2.1 Définition de la perméabilité vasculaire 
6.2.2 Méthodes microscopiques de mesure 
6.2.3 Principe de la méthode développée pour la microscopie biphotonique
- Présentation de la méthode différentielle 
- Détermination du rapport des concentrations extra et intravasculaires du colorant diffusible
- Estimation de la perméabilité ? 
- Discussion de cette méthode : quel domaine de validité ? 
6.3 Intérêts et limitations 
- Les observations récentes de diffusion 
Conclusion et perspectives
A Mesure de la résolution spatiale de notre montage et étude de la précision du déplacement de l'objectif 
- Résolution latérale 
- Résolution axiale 
- Vérification de la crémaillère